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PCR儀有關(guān)的分子信標技術(shù)介紹

發(fā)布時間: 2021-12-20  點擊次數(shù): 1383次
   隨著PCR技術(shù)的發(fā)展與廣泛應(yīng)用,利用PCR的定量技術(shù)也取得了長足的發(fā)展。早期主要采用外參照的定量PCR方法,這種方法因影響因素較多,現(xiàn)已逐漸被內(nèi)參照物定量方法和競爭PCR定量方法所取代,并在此基礎(chǔ)上發(fā)展了熒光定量PCR儀方法,使PCR定量技術(shù)提升到新的水平。
  分子信標技術(shù)也是在同一探針的兩末端分別標記熒光分子和猝滅分子。通常,分子信標探針長約25核苷酸,空間上呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)。與TaqMan探針不同的是,分子信標探針的5'和3'末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu),此時熒光分子和猝滅分子鄰近,因此不會產(chǎn)生熒光。當(dāng)溶液中有特異模板時,該探針與模板雜交,從而使探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開,于是溶液便產(chǎn)生熒光。熒光的強度與溶液中模板的量成正比,因此可用于PCR儀的定量分析。該方法的特點是采用非熒光染料作為猝滅分子,因此熒光本底低。
  常用的熒光猝滅分子對是5'-(2'-氨乙基氨基萘-1-磺酸)(EDANS)和4'-(4'-二甲基氨基疊氮苯)苯甲酸(DAB-CYL),采用DAB-CYL作猝滅劑是由于它對多種熒光素都有很強的猝滅效率。當(dāng)受到336nm紫外光激發(fā)時,EDANS發(fā)出波長為490nm的亮藍熒光;DAB-CYL的是非熒光分子,但其吸收光譜與EDANS的發(fā)射熒光光譜重疊。只有分子信標時,EDANS和DAB-CYL的距離非常接近,足以發(fā)生FRET,EDANS受激發(fā)產(chǎn)生的熒光轉(zhuǎn)移給DAB-CYL并以熱的形式散發(fā),不能檢測到熒光;相反,當(dāng)有靶核酸存在時才可檢測到熒光。
  分子信標技術(shù)的不足之處是:
  雜交時探針不能*與模板結(jié)合,因此穩(wěn)定性差;
  探針合成時標記較復(fù)雜。分子信標技術(shù)結(jié)合不同的熒光標記,可用于基因多突變位點的同時分析。
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